花卉类病毒的诊断和鉴定方法有哪些？
植原体、螺原体等无壁菌门的原核生物造成的植物病害与植物病毒产生的症状相似，无病症表现，因此，它们又叫病毒类似病害。花卉上比较常见的是植原体病害，因此我们介绍一下植原体病害的诊断和鉴定。
1 超薄切片，电镜下观察植原体
方法如植物病毒的超薄切片和电镜观察。
2 抗生素治疗诊断
用四环素、土霉素和金霉素等对受病植株进行叶面喷施和灌根，植原体对这几种抗生素敏感，病害症状可以得到缓解。而植物病毒对抗生素不敏感，如果施用，对病害无效。
3 植原体PCR检测
根据植原体的共同保守序列，用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到植原体的特异扩增带。
还可以将直接PCR产物分别稀释40倍后，引物换为R16R2/R16F2进行巢式PCR扩增，可得到与引物设计相符的植原体的特异扩增带，说明为植原体病害。
这里以仙人掌植原体丛枝病的PCR检测为例，介绍植原体的PCR检测技术。
实验操作如下：
Ⅰ.总核酸提取
（1）取0.3g植株幼嫩组织，用液氮冷冻后充分研磨成粉状。
（2）移入含有0.6ml预热到60℃的CTAB DNA提取缓冲液中，在60℃水浴中温浴30min。
（3）加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），抽提30min。
（4）12000r/min离心8min，取上清液，重复（3）、（4）步直至蛋白质除尽。
（5）加入氯仿∶异戊醇（24∶1），抽提30min，12000r/min离心8min，取上清液。
（6）加入等体积预冷的异丙醇及1/10体积的醋酸钠（3mol/L，pH5.2），混匀，-20℃保持至少30min，14000r/min离心10min，使核酸沉淀。
（7）用70%乙醇洗涤2次后，.真空干燥。
（8）沉淀溶解于100μl TE缓冲液中。
（9）取10μl DNA经0.7%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，计算DNA浓度。其余于-20℃冰箱中保存备用。
Ⅱ.PCR扩增
参照Lee所报道的植原体16S rRNA基因通用引物对R16mF2/R16mRl序列和R16F2/R16R2序列合成引物，引物序列如下：
R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′
R16mRl：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′
R16F2：5′-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3′
R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′
引物溶解于适量灭菌水中至终浓度为10μmol/L。
直接PCR（Direct-PCR）：
（1）取一PCR薄壁管，依次加入下列试剂
10×PCR反应缓冲液 5μl
5mmol/L MgCl2 4μl
2.5mmol/L dNTP 4μl
R16mF2（或R16F2） 3μl
R16mRl（或R16R2） 3μl
4U/μl 1TaqDNA聚合酶 1μl
模板 2μl
加入双蒸水至终体积为50μl，混匀并加入30μl石蜡油。
（2）PCR扩增。反应循环为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，35个循环后于72℃保温10min，4℃冰箱中保存。
（3）取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。
巢式PCR（Nested-PCR）：
将用引物对R16mF2/R16mRl扩增的直接PCR产物按1∶40比例稀释后，作为反应模板，引物对换为R16F2/R16R2，退火温度升高至60℃，其余反应条件同直接PCR。
Ⅲ.结果
用植原体16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2进行植原体直接PCR扩增，可扩增到一条约1.5kb的特异扩增带（图1）。通过实验，用泡桐丛枝作为植原体的阳性对照，检测出YNOl样品（仙人掌品种珊瑚枝丛枝）和YNO2（仙人掌品种堆罗汉丛枝）为植原体病害。其他YNO3（仙人掌品种猪耳掌丛枝）、YNO4（仙人掌品种金狮子丛枝病）、YNO5（仙人掌品种青海波丛枝）不是植原体病害，可能为品种的特性。
图1 直接PCR扩增结果
将直接PCR产物分别稀释40倍后，引物换为R16R2/R16F2进行巢式PCR扩增，可得到一条约1.2kb的特异条带，与引物设计相符（图2），说明为植原体病害。直接PCR的检测灵敏度为10pg DNA，而巢式PCR可以提高检测灵敏度。使用直接PCR的检测得到比较模糊条带的，使用巢式PCR可以得到非常明显的条带。
图2 巢式PCR扩增结果
生物学检测：利用类病毒的特异鉴别寄主来诊断和检测。如菊花矮化类病毒（CSVd），可以从待检样品中抽提低分子RNA，接种到特定的指不植物，如菊花Mistletm品种、爪哇三七（Gynura：auanyiana）、番茄（Lycopersicon：esculentum）。
接种缓冲液的组成是100mmolTris，10mmolEDTA，pH7.5。接种时用沾有接种原的刹须刀在菊花和爪哇三七的茎部轻轻切割5～10刀，再用棉棒涂抹。番茄可以用4～5叶期的幼苗直接用涂抹法接种。被接种植物放在30℃左右的温室培育，观察症状。接种36d后，菊花上出现黄色斑点，顶叶较少，从上数第3～5叶上症状更明显。
接种45d后，爪哇三七出现顶叶卷曲症状。但没有柑橘裂皮病类病毒接种时症状明显。接种60d后，番茄上不表现任何症状。但回接菊花Mistletm品种，证明CSVd在番茄上属于潜伏侵染。
生物检测需要严格的温度条件，如果温度条件控制不严格便难以得到可信的结果。此外，检测批量样品，还需要较大的空间。
类病毒因为不具有外壳蛋白，所以不能用血清学、电镜等方法来诊断和检测。类病毒常用的检测方法有生物学检测、双向电泳、RT-PCR和分子杂交等方法。
1 生物学检测
利用类病毒的特异鉴别寄主来诊断和检测。如菊花矮化类病毒（CSVd），可以从待检样品中抽提低分子RNA，接种到特定的指不植物，如菊花的Mistletm品种、爪哇三七（Gynura auanyiana）、番茄（Lycopersicon esculentum）。接种缓冲液的组成是100mmolTris，10mmolEDTA，pH7.5。接种时用沾有接种原的刹须刀在菊花和爪哇三七的茎部轻轻切割5～10刀，再用棉棒涂抹。番茄可以用4～5叶期的幼苗直接用涂抹法接种。被接种植物放在30℃左右的温室培育，观察症状。接种36d后，菊花上出现黄色斑点，顶叶较少，从上数第3～5叶上症状更明显。接种45d后，爪哇三七出现顶叶卷曲症状。但没有柑橘裂皮病类病毒接种时症状明显。接种60d后，番茄上不表现任何症状。但回接菊花的Mistletm品种，证明CSVd在番茄上属于潜伏侵染。
生物检测需要严格的温度条件，如果温度条件控制不严格便难以得到可信的结果。此外，检测批量样品，还需要较大的空间。
22 双向电泳检测
2.1 核酸的抽提
抽提缓冲液的组成为0.13mol Tris-HCl、0.017mol EDTA、1mol LiCl、0.83%DS，5%PVP，简称为TESLP。1g鲜菊花叶片加2～5倍体积的TESLP缓冲液磨碎，加入等体积的水饱和酚∶氯仿（1∶1）处理，离心分离后用乙醇沉淀回收全核酸。之后用methoxy ethaml除去多糖，用CTAB回收核酸，加等体积的4mol的LiCl，离心回收2mol LiCl的可溶组分，用乙醇沉淀浓缩后溶于适当体积的TE（10mmol Tris-HCl，1mmol EDTA，pH8.0）溶液中。
2.2 正反向电泳
按照Singh等的方法进行。首先在室温下用1倍TBE电泳缓冲液分离核酸，直到染料XC-FF达近底部的7.5%为止。然后换成加热到沸腾的0.125倍TBE电泳缓冲液，颠倒正负极并用表面加热器保持电泳板的温度在80℃以上，直到染料XC-FF到达胶的上端。电泳完后用银染色观察核酸的有无（图1）。
图1 正反向电泳法检测菊花矮化类病毒RNA示意图
正反向电泳结果如图2所示，从健康的菊花（Mistletm）及正常的植株中未检测到类病毒RNA，从相当于菊花鲜叶重2.8mg的核酸样品中检测到了CSVd核酸条带。
图2 正反向电泳法检测菊花矮化类病毒
与生物接种相比，正反向电泳凝胶电泳检测菊花矮化类病毒，可以从相当于2.8mg鲜重的菊花样品中检测到菊花矮化类病毒CSVd，并同时可检测10～20个样品材料。总之，制备用于正反向电泳的粗核酸的方法简便，需要的鲜叶量少，可以作为该类病毒的常规检测方法。正反向电泳凝胶电泳与双向凝胶电泳比较，省去了第一项电泳完后割胶回收的试验步骤，操作更为简便。
花卉病毒病的症状要怎样诊断?
答：花卉病毒病的症状初步诊断：花卉植物病毒病几乎都属于系统性侵染的病害，即当寄主植物感染病毒后或早或迟都会产生全株性病变和症状。病害的症状特点，对病害的诊断无疑是有很大的参考价值。此外在描述外部症状的同时还得注意环境条件、发病规律、传毒方式、寄主范围等特点，使对病害的诊断有个比较正确的结论...
植物病毒种类的诊断分为哪几种?
答：鉴定是确定某一未知标样是什么病毒的工作，当取得某一标样时，根据已有资料认为可能是一种新的病毒，但不能判断对其究竟为何种病毒，因而必须对其各方面的性状进行全面检查，如：寄主范围（寄主的种类，在不同寄主上的反应和症状）；传播途径（有无传毒介体，介体种类和传毒方式，能否种子传毒及种传寄主...
啤酒花矮化类病毒病是怎样检验与检疫的?
答：检疫危险性评价：本病的病原体啤酒花矮化类病毒，可经啤酒花繁殖材料远距离传播，无介体传毒，严重危害啤酒花，国内已有发生，季良进行危险性评价时，危险度值6分，为低危检疫性有害生物。地理分布：分布全世界（欧洲、美国、中国、日本）（Sanoetal.，1986）。日本啤酒花原先种植在东北区（本州北部）...
试比较病毒与类病毒诊断鉴定方法的异同。
答：随着许多病毒全基因组序列的测定及分子生物学技术的迅速发展，病毒鉴定往往通过对病毒基因组全序列或部分序列的测定，然后与已知病毒的序列进行比对来精确确定病毒的种类。植物病毒常用的鉴定方法包括生物学测定、电子显微镜技术、血清学技术和分子生物学技术等。类病毒(viroid)与病毒引起植物病害在症状上没有...
玫瑰月季的黄花叶病有哪些检疫方法?
答：2.电镜鉴定：用病组织浸渍法或提纯病毒制剂制片观察病毒粒体形态大小，如果加入特异抗血清诱捕或诱捕修饰法可获得更直观的诊断效果。3.血清学检测：琼脂双扩散、对流免疫电泳和酶联免疫吸附试验可以直接检测PNRSV。4.RT-PCR检测：根据该病毒核酸序列设计引物，进行RT-PCR扩增，电泳检测。
如何利用生物学方法鉴别植物病毒?
答：在植物病毒诊断中所采用的生物学方法是基本的手段，也是取得该病毒有关特性的第一手资料。生物学测定方法有：鉴别寄主或指示植物反应，传播途径测定，寄主范围测定等。鉴别寄主（诊断寄主）是指病毒或某一株系在一些特定植物上能引起专化性症状反应，这种专化性或特殊症状反应与其他病毒在该植物上的侵染...
大丽花花叶病的检测方法有哪些?
答：1.电镜下确证直径50nm球状病毒粒体。2.利用大丽花花叶病毒抗血清进行检测。3.根据鉴别寄主百日草、蛇目菊、克利夫兰烟、矮牵牛、龙葵的反应诊断。【防治】1.及时拔除有病的大丽花植株。2.建立起无病毒大丽花母本园基地，并加强对内对外的病毒检疫工作。3.及时防治叶蝉及多种蚜虫介体。常用的杀虫剂有50%...
花卉脱毒苗的鉴定包括哪些方面?
答：采用茎尖培养法所获得的茎尖苗并非全部植株都脱除了病毒。由于植物的品种不同，所取茎尖的大小以及病毒种类不同，有些植株脱毒了，有些仍然带有病毒，因此还需要对茎尖苗作带毒状况测定，去除那些带毒株。病毒鉴定的依据是症状的有无、症状特征、抗血清反应、PCR或分子杂交、电镜检查、生物学测定结果等。
植物病毒检测的血清学技术都有哪些?
答：此法可克服塑料板的不足,只用目测就可对结果定性,不需要复杂的仪器,所需抗原抗体量均很少,灵敏度比常规酶联法高10倍以上,适合大量抗原的检测。 6.免疫电镜 电镜检测可快速确定病毒粒子的形状,是鉴定病毒不可缺少的技术,但有的样品浓度很低,用普通的电镜技术不易观察,如将病毒粒子包被后,抗体可把病毒粒子捕捉成...
